Слабоосновные флуоресцентные красители используют для того, чтобы визуализировать органеллы в живых клетках благодаря их сродству с кислыми субклеточными органеллами. В частности, их используют чтобы окрашивать кремнезём, откладываемый в везикулах отложения кремнезёма (SDVs) диатомей в ходе синтеза их панциря. Настоящее исследование включило в себя синтез флуоресцентных красителей, получаемых из олигопропиламинов, соединений сходных с веществами, обнаруженными в диатомеях. Эти красители получены реакцией олигопропиламинов с 4-хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом. Реакция проводилась с использованием метилированных олигопропиламинов, содержащих два или три атома азота с получением двух новых флуоресцентных красителей: NBD-N2 и NBD-N3. Оказалось, что эти красители проявляют высокую эффективность в прижизненном окрашивании растущих кремнистых панцирей диатомей при концентрациях, по крайней мере, в 10 раз более низких, чем концентрации, требующиеся для окрашивания красителем HCK-123. NBD-N3 также эффективно окрашивал другие субклеточные везикулы эукариотических одноклеточных водорослей. NBD-N2 окрашивал только растущие диатомовые панцири, тогда как NBD-N3 также окрашивал различные субклеточные органеллы различных эукариотических одноклеточных водорослей. NBD-N2 и NBD-N3 не удалялись из окрашенных панцирей диатомей жёсткими обработками при помощи H₂SO₄ и H₂O₂. Флуоресцентный кремнезём можно также получить его химическим осаждением в присутствии NBD-N2 и NBD-N3.

Рис. 2. Синтез новых флуоресцентных красителей NBD-N2 и NBD-N3.

Рис. 3. Спектры адсорбции (A) и флуоресценции (B) NBD-N2 и NBD-N3. Длина волны возбуждающего света, использованного для получения спектра эмиссии, была 470 нм, она соответствует длине волны возбуждающего света флуоресцентного микроскопа.

Рис. 5. Изображения, сделанные при помощи флуоресцентной микроскопии, клеток Synedra acus, растущих в присутствии HCK-123 (A-D), NBD-N2 (F-K) и NBD-N3 (L-Q) в течение 24 ч. Также показаны изображения, сделанные при помощи световой микроскопии, клеток S. acus (E). Концентрации красителей в культуральной среде были 1, 0.5, 0.25, 0.1, 0.01 и 0.005 µM (слева направо). Масштаб соответствует 10 µм. Условия съёмки микрофотографий (мощность лампы, диафрагма и экспозиция) идентичны во всех случаях. Метки на световых изображениях: Cl, хлоропласты (красная флуоресценция); V, створки родительской клетки; SDV, физикулы отложения кремнезёма, в которых формируются новые створки.

Рис. 6. Оптические (A и B) и флуоресцентные (C-G) микрофотографии цианобактерии Anabaena sp. (B, D и G) и зелёной водоросли Monoraphidium sp. (A, C, E и F), выросших в присутствии 0.25 µM NBD-N2 (C и D) и NBD-N3 (E-G). Масштаб соответствует 10 µм. Инкубирование с 0.50 µM красителя дало сходный результат.

Рис. 7. Световые (A, F и H) и флуоресцентные (B-E и G) микроскопические изображения кремнистых панцирей S. acus, выращенной в присутствие NBD-N3 (B, D, G, and H) and NBD-N2 (C, E, and F). Изображения C-H получены после окисления органических компонентов смесью H₂SO₄/H₂O₂. Концентрация красителей в культивационной среде 0.5 µM. Продолжительность культивации 72 ч. Полоска масштаба соответствует 10 µм в секциях A-D, F и G и 1 µм в секциях E и H. Рис. 8. Изображения, сделанные при помощи световой (A-C) и флуоресцентной микроскопии (D-F), частиц синтетического кремнезёма, полученного в присутствии HCK-123 (A и D), NBD-N2 (B и E), и NBD-N3 (C и F). Концентрация красителей в реакционной смеси была 0.02 мМ. Масштаб соответствует 10 µм.