Методы, используемые в отделе
Методы фиксации и заливки образцов для ТЭМ
- Методика фиксирования и приготовления ультратонких срезов клеток простейших и микроводорослей.
- Метод фиксации и заливки диатомовых водорослей в блок
(используется д-ром R.Crawford, AWI, Bremerhaven, Germany)
- Метод фиксации и заливки диатомовых водорослей в плоскости
- Методика подготовки нервной ткани для просвечивающей электронной микроскопии.
- Схема подготовки микроорганизмов для просвечивающей электронной микроскопии
- Фиксация диатомовых водорослей (по Pickett-Heaps, Hill, Wetherbee, 1986)
Методы молекулярной биологии
- АМПЛИФИКАЦИЯ (PCR)
- Отбор клеток диатомовых водорослей из свежих или фиксированных проб фитопланктона для последующего
выделения суммарной ДНК и амплификации.
- Выделение суммарной клеточной ДНК из выборки клеток диатомовых водорослей с
использованием СТАВ-буфера.
- Выделение ДНК
- Выделение суммарного цитоплазматического белка
- Выделение суммарного цитоплазматического белка из клеток S. acus
- Очистка реакций секвенирования ДНК от невключившихся BigDye-ddNTP
- Фракционирование белков E. coli
- Метод выделения ДНК из индивидуальных клеток ДВ для использования в ПЦР (Щербакова Т.А.)
Методы мониторинга
- Методика окрашивания флагеллят примулином.
Методы подготовки образцов для СЭМ
- A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane Christian Laforsch and Ralph Tollrian
- TECHNIQUES FOR PREPARING CRUSTACEANS FOR SCANNING ELECTRON MICROSCOPY Bruce E. Felgenhauer
(Перевод)
- Particle capture and processing mechanisms in Sabellaria alveolata (Polychaeta: Sabellariidae) Stanislas Dubois, Laurent Barille, Bruno Cognie, Peter G. Beninger
Ссылки:
Электронная микроскопия
Контрастирование ультратонких срезов
PEARL
Метод фиксации и заливки диатомовых водорослей в блок
(используется д-ром R.Crawford, AWI, Bremerhaven, Germany)
- 1% OsO4, 1 мин.
- Отмывка: добавить в пробирку 0,1М фосфатный буфер, рН=7,1, центрифугировать 5 мин., повторить еще раз
- 3% глютаровый альдегид, 1 час.
- Отмыть буфером 2-4 раза, можно оставить в буфере на 6 час.
- Проводка в спиртах по 10 мин. с осаждением центрифугированием:
10% -> 30% -> 50% -> 70% -> 90% ->100% -> 100%
- Заливка:
продолжительность | состав смеси в частях |
| 100% этанол | смола |
ночь | 3 | 1 |
день | 2 | 2 |
ночь | 1 | 3 |
- Полимеризация: не менее 8-12 часов при 60оС
С вопросами обращаться по адресу yel@lin.irk.ru
вверх
Метод фиксации и заливки диатомовых водорослей в плоскости
- Обезвоживание:
- После второй промывки 100% этанолом и центрифугирования (п. 5 предыдущая метьдика) отмыть смесью 100% этанол:
ацетон (1:1 или 10 мл + 10 мл), центрифугирование 5 мин.
- Насыщение смолой:
- залить осадок смесью ацетон: смола (1:1 или 10 мл + 10 мл)
- выдержать не менее 30 мин. при ком. температуре, центрифугировать 10 мин.
- Удалить супернатант пипеткой, осадок встряхнуть в остатке супернатанта и залить 100% смолой на 30 мин.
- В это время приготовить стекла:
- протереть 70% спиртом
- сбрызнуть Teflon-spray e-plus, протереть
- на предметное стекло положить с двух сторон кусочки покровного стекла (такой толжены будет блок)
- приготовили маленькую чашку Петри
- Центрифугировать 10 мин., смолу удалить
- Остаток смолы с осадком перемешали, капнули в чашку и равномерно в ней распределили
- По несколько капель нанесли на стекла, равномерно распределили и накрыли сверху вторым предметным стеклом
- Залили остаток смолы в пустые капсулы для получения пустых блоков, к которым будут приклеиваться плоские блоки
- Полимеризация ночь при 60оС
- На следующий день стекла разлепили, из чашек вынули блок
- Под световым микроскопом проконтролировали плотность нанесения материала и состояние клеток, выбрали интересные участки
- Свежим лезвием изготовили пирамидки из пустых блоков
- 1/4 обычноголезвия для бритья вырезали из смолы выбранные объекты и отделили их от стекла.
- Тут же замесили на стекле эпоксидный клей и приклеили им вырезанные кусочки к пустому блоку
- Выдержали 1 час при 60оС, чтобы застыл клей
- Получили ультратонкие срезы с помощью алмазного ножа
- Окрасили их на капле насыщенного раствора уранил-ацетета (1 мин.), отмыли споласкиванием сеточки в дист воде,
окрасили на капле цитрата свинца.
- Сполоснули, разместили на фильтровальной бумане в чашке П. для высыхания.
- Препарат готов для просмотра в ТЭМ.
С вопросами обращаться по адресу yel@lin.irk.ru
вверх
АМПЛИФИКАЦИЯ (PCR)
Реактивы
- Очищенная суммарная ДНК
- праймеры, 10 pmol\мкл
- раствор cуммарных 8мМ dNTP по 2 мМ каждого
- 10xPCR буфер
- MgCl2, 25 mM
- фермент Taq-полимераза, 3 unit\мкл
Метод
- достав реактивы из морозильной камеры, выдержать их в ледяной бане до полного размораживания
- перемешать каждый реактив встряхиванием пробирки
- рассчитать реакцию
- промаркировать крышки 0,5 мкл пробирок личным символом и номером реакции (N 2/4, где N - личный символ,
верхняя цифра(2)- порядковый номер реакции, а нижний (4) - номер пробирки в реакции)
- прилить реактивы в следующем порядке (для 25 мкл реакционной смеси):
- бидистиллированная вода
- 4 мкл MgCl2 (оптимум Mg+2 определяется титрованием)
- 2,5 мкл 10xPCR буфер
- 2,5 мкл сумма dNTP (0,2 мМ каждого NTP)
- 1 мкл каждого праймера
- 1 мкл ДНК или по обстоятельствам
Для каждого реактива и каждого вида ДНК - новый носик
- тщательно перемешать раствор в пробирках, осадить раствор ц\ф, 5 сек
- включить термосайклер, прогреть крышку, блок, поставить пробирки
- за 1-1,5 мин до окончания hot start добавить по 2 мкл раствора фермента в каждый образец
Расчет фермента: 2х (n+1) = Vф мкл
0,1Vф 10 x PCR буф
+0,3х(n+1) фермента
+Н2О бд
Аналитический электрофорез в 1% агарозном геле
- к 0,5 г агарозы добавить 50 мл 1хТВЕ буфера
- расплавить в микроволновой печи до прозрачного раствора без взвеси и пузырьков
- остудить до 60оС, прилить 10 мкл р-ра 0,1 % EtBr
- вылить в плато с гребенкой
- после полимеризации (30-40 мин), вытащив гребенку, поместить в камеру для фореза
- налить 0,5 хТВЕ буфер, вустановить электроды, ДНК движется от "-" к "+"
- приготовить образцы для нанесения:
- 3 мкл буфера для нанесения (75 мМ EDTA,15% глицерин, 0,02% бромфенол)
- 5 мкл образца, перемешать пипетированием
- нанести в карманы геля.
Электрофорез проводят при U = 80в, в течение 30-40 мин.
Продукты амплификации, окрашенные бромистым этидием, наблюдают в УФ свете, фотографируют.
Литература
- Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование: Практическое пособие.
М. Наука. 1981. 288 с.
- Дреипер Дж., Скотт Р., Армитижд Ф., Уолден Р., Генная инженерия растении . М.: Мир. 1991. 408 с.
- Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984. 480 с.
- Doyle J. J. & Doyle J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12 : 13-15.
вверх
Отбор клеток диатомовых водорослей из свежих или фиксированных проб фитопланктона для последующего
выделения суммарной ДНК и амплификации.
Клетки или колонии диатомовых водорослей отбирают по морфологическим маркерам, характерным для исследуемого вида (форма,
размер, структура панциря или колоний, наличие спор и т.д.). Отбор клеток ведут из свежих или фиксированных в 80% этаноле водных
проб с помощью микропипетки, оттянутой из стеклянного капилляра (диаметром 0.5-0,3 мм), под бинокулярной лупой. Выборка клеток для
получения количества ДНК, достаточного для проведения последующих реакций амплификации, составляет две - три сотни клеток.
- 5 -10 мкл пробы (в зависимости от ее концентрированности) помещаются на предметное "часовое" стекло в каплю дистиллированной
воды ("первая капля").
- Наблюдая в бинокулярную лупу, нужные клетки (колонии) водоросли микропипеткой аккуратно переносят в следующую
каплю ("вторую").
- Повторяя пункт 2, отбираемые клетки последовательно проводят через 4-6 капель дистиллята, для того, чтобы конечная выборка была
очищена от механических примесей и состояла только из клеток исследуемого вида. Финальная капля контролируется под микроскопом
на большом увеличении.
- Клетки из последней капли переносят в эппендорф объёмом 1,5 мкл, для выделения нуклеиновых кислот или хранят в 80% этиловом
спирте при 4оС.
Литература
- Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование: Практическое пособие.
М. Наука. 1981. 288 с.
- Дреипер Дж., Скотт Р., Армитижд Ф., Уолден Р., Генная инженерия растении . М.: Мир. 1991. 408 с.
- Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984. 480 с.
- Doyle J. J. & Doyle J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12 : 13-15.
вверх
Выделение суммарной клеточной ДНК из выборки клеток диатомовых водорослей с использованием
СТАВ-буфера.
Метод выделения суммарной клеточной ДНК из растительного материала основан на том, что при высоких концентрациях солей,
нуклеиновые кислоты образуют стабильные и растворимые соединения с цетилтриэтиламмоний бромидом. При снижении концентрации
соли NaCl ниже 0,4 М комплекс СТАВ/н.к. выпадает в осадок.
После разрушения клеток белки денатурируют и экстрагируют смесью хлороформа с изоамиловым спиртом. СТАВ удаляют путем
осаждения этанолом (СТАВ растворим в этаноле, а ДНК нет).
Для выделения суммарной клеточной ДНК из диатомовых водорослей используют СТАВ-буфер следующего состава: 3% СТАВ,
1,4 М NaCl, 0,2% 2-меркаптоэтанол, 20 mM EDTA, 100 mM Tris -HCl (pH 8,0).
Выделение:
- отобранные клетки отмывают от фиксатора (если проба фиксирована 80% этанолом) центрифугированием в течение 5', удалением
спирта, добавлением воды; повторяют - 2 раза;
- отбирают надосадочную воду, а осадок заливают 50 - 100 мкл предварительно прогретого при 60оС СТАБ-буфера,
помещают пробирку в термостат (60оС) и тщательно растирают пестиком в течение 5 минут для разрушения прочных
кремнистых стенок;
- добавляют еще 100 мкл СТАБ-буфера и инкубируют в термостате при 60оС в течение 30 минут, периодически перемешивая
раствор вращением пробирки (трясти пробирку не рекомендуется т. к. буфер пенится, ДНК разрушается);
- остудив пробирку до комнатной температуры, добавляют равный объём смеси хлороформ - изоамиловый спирт (24:1) и
перемешивают медленным покачиванием в течение 10 мин;
- разделяют фазы центрифугированием 10 мин (15000 об/мин)
- супернатант переносят в чистую пробирку объемом 1,5 мл
- добавляют 2/3 объема изопропанола
- оставляют на ночь при -20о для осаждения ДНК
- центрифугируют 20 мин, отбирают изопропанол
- добавляют два объема 80% этанола, инкубируют 20 мин, центрифугируют 2 мин, тщательно удаляют спирт, подсушивают пробирку
на воздухе для удаления паров спирта
- осадок ДНК растворяют в 20 мкл воды или ТЕ-буфера (0,01М трис-HCl, pH-7,4, 0,1mM EDTA), до полного исчезновения осадка
(прогревание при 60оС в течение 10 - 20 мин способствует растворению).
Полученный препарат тотальной ДНК (примерно 0,3 -0,8 нг ДНК) хранят в холодильнике, не замораживая, используют для
реакций амплификации и др.
Литература
- Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование: Практическое пособие.
М. Наука. 1981. 288 с.
- Дреипер Дж., Скотт Р., Армитижд Ф., Уолден Р., Генная инженерия растении . М.: Мир. 1991. 408 с.
- Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984. 480 с.
- Doyle J. J. & Doyle J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12 : 13-15.
вверх
Методика подготовки нервной ткани для просвечивающей электронной микроскопии.
- Изолированная ткань с помощью острого лезвия рассекается на отдельные
небольшие фрагменты (1-3 мм3) и фиксируется 1-2 часа при температуре +4 С в 2,5
% растворе глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2-7,4);
- Промывание образцов в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2-7,4) 10 мин;
- Фиксация материала в 1-2 % р-ре OsO4 на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2-7,4)
1-12 час. на холоду (+4 С);
- Обезвоживание в спиртах восходящей концентрации: 30%, 50%, 70%, 96%, 100%,
абсолютный ацетон (в каждом из растворов объекты выдерживаются по 20-30 мин.);
- Изготавливается заливочная смесь, состоящая из следующих компонентов
эпоксидных смол: эпон 812 (4,5 мл.) + MNA (2,23 мл.) + DDSA (2,72) +DMP-30 (5
капель). Смесь тщательно перемешать стеклянной палочкой. (Заливочная смесь может
храниться в морозильной камере холодильника);
- Кусочки обезвоженной ткани далее инфильтруются растворами абсолютного ацетона
и заливочной смолы по схеме:
- ацетон (3 части) : заливочная смесь (1 часть)- 1 час;
- ацетон (2 части) : заливочная смесь (1 часть) - 1 час;
- ацетон (1 часть) : заливочная смесь (1 часть) - держать 1 час в контейнере с
закрытой крышкой и далее 12 час. с открытой крышкой;
- Кусочки ткани, пропитанные смолой, опускаются и ориентируются в желатиновых
капсулах, предварительно заполненных свежей заливочной смолой;
- Полимеризация образцов в термостате 37 С 12 час., 45 С 12 час., 60 С 48 час.;
- Заточка блоков, получение полутонких и ультратонких срезов, монтирование срезов на сеточки;
- Контрастирование ультратонких срезов в цитрате свинца по Рейнольдсу.
Литература:
- А.А. Миронов, Я.Ю. Комиссарчик, В.А. Миронов. Методы электронной микроскопии в
биологии и медицине. Санкт-Петербург. Наука. 1994;
- В.Я. Карупу. Электронная микроскопия. Киев.1984;
вверх
Методика фиксирования и приготовления ультратонких срезов клеток простейших и микроводорослей.
- Живые клетки из пробы или культуры концентрируют, осаждая в центрифуге при скорости 5-8 тыс об / мин. (диаметр ротора 12 см).
- Материал из проб или культур фиксируют смесью глутаральдегида забуференного 0.2 М какодилатом натрия (рН 7.4) и
четырехокиси осмия, (конечные концентрации соответственно 0.5 и 0.25%) в течении 30-40 минут при +40С. Последние 5 минут
материал в фиксаторе осаждают, центрифугируя при скорости 2 тыс об/мин. (диаметр ротора 12 см.). Фиксатор осторожно сливают,
осадок заливают горячим агаром 0.5% (минимальное количество).
- Агар с клетками помещают в какодилатный буфер (рН 7.4) и скальпелем вырезают кусочки с материалом так, чтобы "свободного"
агара не оставалось.
- Кусочки агара помещают в четырехокись осмия 1% для постфиксации и выдерживают в течении часа на холоду
(обычно на чашке со льдом).
- Объекты проводят через этиловый спирт возрастающей концентрации и ацетон: 30 (15') - 50 (15') - 70 (15') - 70 (15'; можно также
хранить длительное время) - 80 (15') - 96 (15') - 96 (15') - cмесь спирт-ацетон 1:1 (15') - ацетон (15') - ацетон (15') - смесь ацетон-смола 1:1
(12-24 часа)
- Материал помещают в смолу. Дальнейшие действия по стандартной методике.
Литература
- Mignot J-P. Etude ultrastructurale d'un flagella du genere Spumella Cienk. (Chrysomonadine leucoplastidee)
// Protistologica.- 1977.- Vol. 13 (2).- 219-231.
- Preisig H.R., Hibberd D.J. Ultrastructure and taxonomy of Paraphysomonas (Chrysophyceae) and related genera 1
// Nord. J. Bot. - 1982. - Vol. 2 (5).- 397-420.
вверх
Методика окрашивания флагеллят примулином
Приготовление раствора примулина
-
Приготовить 200 мл 0,1М трис-буфера и довести раствор до рН=4. К 10 мг порошка примулина добавить 40 мл буфера, поставить на ночь
в холодильник для более полного растворения флуорохрома. Краситель может храниться в холодильнике, в темной посуде, в течение
месяца. Возможно неполное растворение частиц красителя, тогда перед употреблением раствор необходимо профильтровать.
Приготовление постоянных препаратов для эпифлуоресцентной микроскопии (ЭФМ)
-
Фиксированные формалином или глутаральдегидом (конечная концентрация фиксатора 2%) водные пробы фильтруют при низком вакууме
(<0,3 атм.) через поликарбонатные окрашенные фильтры Millipore с диаметром пор 0,2 µм. Затем удаляют вакуум и на 3-5 мин добавляют 1
мл раствора примулина. Промывают тремя миллилитрами 0,1М трис-буфера (рН=4). Высушенный на воздухе фильтр помещают на
предметное стекло с каплей иммерсионного масла Olympus. В центр фильтра также капается масло, после чего он заключается под
покровное стекло. Готовые препараты хранятся в темноте, в холодильнике.
Окрашенную примулином пробу просматривают на ЭФМ при увеличении x1250, используя голубой и фиолетовый светофильтры.
При возбуждении светом данной длины волны, окрашенные объекты флуоресцируют светло-зеленым и голубым, соответственно.
Примулин является неспецифичным красителем, помимо клеток и жгутиков гетеротрофных нанофлагеллят (отряды Dinoflagellida, Choanoflagellida)
окрашиваются также панцири Dinobrion, Peridinium, визуализируются и другие представители зоо- и фитопланктона.
Окрашенные примулином препараты могут использоваться для подсчета как флагеллят, так и автотрофного цианобактериального
пикопланктона. Учет флагеллят удобно производить с использованием голубого светофильтра, под которым они флуоресцируют
светло-зеленым, а автофлуоресценция цианобактерий практически не видна. При смене светофильтра на зеленый в поле зрения
остаются только цианобактерии, флуоресцирующие ярко-красным, благодаря наличию вспомогательных фотосинтетических
пигментов - фикоэритрина и фикоцианина. Флуоресценция примулина при данной длине волны полностью отсутствует.
вверх
Выделение суммарного цитоплазматического белка из клеток S. acus
(при помощи набор для выделения клеточных белков Total Protein Kit фирмы Bio - Rad (“Bio-Rad”, США)).
1. Клетки в количестве 150 млн концентрируют из культуральной среды при помощи фильтровальной установки (“ Millipore ”, США).
2. Клетки отмывают от среды центрифугированием ( 7 500 g , 15 мин, MiniSpin , “ Eppendorf ”, Германия) надосадочную жидкость удаляют, а к осадку добавляют воду, процедуру повторяют.
3. Осадок клеток растирают до гомогенного состояния в ступке на холоде в течение 5 мин для разрушения прочных кремнистых стенок, контролируя степень разрушения створок под микроскопом ( Axiovert 200, “ Zeiss ”, Германия).
4. Гомогенат переносят в пластиковую пробирку на 1,5 мл и добавляют Total Protein 300 мкл, обрабатывают ультразвуком в течение 4 мин с охлаждением.
5. Осаждают центрифугированием ( 7 500 g , 30 мин) , отбирают супернатант, который в дальнейшем использовали как образец для нанесения на электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).
Выделение суммарного клеточного белка с предварительным растворением панцирей диатомовых водорослей
1. Для растворения кремнистого панциря и освобождения связанного с ним органического материала проводят обработку клеток 5М фторидом аммония ( NH 4 F ), pH 5.0, (4 оС, 12 ч) в присутствии ингибиторов сериновых и цистеиновых протеаз 3 мМ ФМСФ ( m / v ) и 3 мМ йодуксусной кислоты ( m / v ).
2. Образовавшийся после центрифугирования ( 12 100 g , 3 мин) осадок ресуспендируют в 500 мМ Трис- HCl , pH 8.8, и центрифугируют в тех же условиях. Промывку повторяли дважды.
3. Затем осадок обрабатывают ультразвуком и проводят карбоксиметилирование 5 мМ йодуксусной кислотой в 0.25 М Трис- HCl , рН 8.8, в присутствии 3 мМ ФМСФ (1 ч, 4 оС, m / v ).
4. Для разрушения дисульфидных связей и солюбилизации белков к осадку добавляют ?-меркаптоэтанол до концентрации 52 мМ в 2 %-ном растворе SDS в 0.25 М Трис- HCl , pH 8.8, полученную суспензию перемешивают при 37 оС в течение 12 ч.
5. Для защиты меркапто-групп цистеина белки повторно карбоксиметилируют, добавляя йодуксусную кислоту до концентрации 54 мМ . Смесь центрифугируют при 12 100 g в течение 2 мин и из супернатанта осаждают белки 80% метанолом ( v / v ) на холоде.
6. Белки растворяют в буфере для нанесения на гель (1% SDS , 10% глицерин, 100 мМ ?-меркаптоэтанол, 50 м M Трис- HCl , pH 6.8) и анализируют с помощью электрофореза в градиенте 5-20% ПААГ (Петрова и др., 2007).
Последовательная экстракция белков из клеток диатомовых водорослей
1. Клетки в количестве 5-8 х10 6, концентрируют фильтрованием и промывают трижды 10 mM Tris - Cl /1 mM C aCl 2 pH 7.4 ( TC буфер).
2. После последней промывки, клетки перенесят в ступку и растирают на холоде c TC буфером, полученный гомогенат центрифугируют, супернатант перенесят в отдельную пробирку – TC -экстракт.
3. Клетки промывают пятикратно TC буфером и добавляют 100 mM этилендиаминтетрауксусную кислоту ( EDTA ) рН 7.8 и инкубируют 12 ч при комнатной температуре, на качалке.
4. Затем, центрифугируют, собрют супернатант – EDTA -экстракт. Осадок промывают водой трижды и инкубируют 30 мин с 1 M NaCl – NaCl -экстракт.
5. Осадок обрабатывают 8 M мочевиной 30 мин, при комнатной температуре, на качалке – эстракт 8 М мочевины.
6. Материал после экстракции трижды промывают водой и мембранные белки экстрагируют 2% SDS при 37 OС, 12 ч, супернатант собирают– SDS -экстракт.
7. Все этапы экстракции проводят в присутствии ингибиторов сериновых и цистеиновых протеаз: 3 мМ ФМСФ и 3 мМ йодуксусной кислоты ( m / v ). полученные белковые экстракты концентрируют 80% метанолом ( v / v ) , 10 мин на холоде. Образцы анализируют с помощью электрофореза в градиенте 5-20% ПААГ ( Frigeri et al , 2006).
Выделение белков, ассоциированных с панцирем диатомовых водорослей
1. Культуру клеток S . acus выращивают на среде ДМ. После того, как количество клеток в культуре достигло 896·10 6, клетки отделяют от среды, как это описывалось раньше.
2. Осадок клеток переносят в пластиковую пробирку и трижды промывают водой.
3. К клеткам ( V =500 мкл) добавляют SDS и EDTA , до концентрации 2% и 0,2М, соответственно, перемешивают при помощи пипетирования и инкубируют на водяной бане ( t = 95 о C ) в течение часа. Центрифугируют ( 7 500 g , 15 мин) и убирают надосадочную жидкость.
4. Осадок промывают водой и повторяют обработку SDS / EDTA дважды. Полученный осадок после третьего кипячения трижды промывают водой и высушивают до сухого веса ( m = 100 мг). После чего к осадку добавляют раствор 2 M NH 4 F , pH 5.0 до полного растворения створок ( V конечный = 56 мл).
5. Полученный раствор диализуют против раствора NH 4 F 1% ( v / v ), c добавлением 3 мМ ФМСФ ( m / v ) в течение 12 час.
6. Супернатант и осадок, выпавший при диализе, разделяют, центрифугированием ( 7 500 g , 15 мин).
7. Осадок обрабатывают буфером (2% SDS , 10% глицерин, 5% ? - меркаптоэтанол, 0,065 M Трис- HCl pH 6,8) трижды по 5 мин на водяной бане (95 оС), после каждого раза центрифугируют ( 12 100 g , 3 мин), отбирают супернатант, а осадок заливают новой порцией буфера.
8. В дальнейшем супернатант используют как образец для измерения поглощения на длинах волн 220-300 нм и для ПААГ-электрофореза.
Определение концентрации белка по методу Брэдфорда
1. Для определения концентрации белка по методу Брэдфорда ( Bradford, 1976) строится калибровочная кривая стандартного раствора бычьего гамма глобулина (БГГ, 2 мг/мл) Bio - Rad .
2. Подготавливают следующие разведения БГГ: 1000 мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 61 мкг/мл, 30,6 мкг/мл, 15 мкг/мл и 7,6 мкг/мл. К 50 мкл белкового раствора добавлют 200 мкл реагента Брэдфорда, затем измеряют оптическую плотность при помощи спектрофотометра “ SmartSpec TM Plus ” ( Bio - Rad) на 595 нм.
3. Из образцов, полученных при выделении белка, отбирают по 50 мкл, добавляют 200 мкл реагента Брэдфорда, измеряют оптическую плотность (595 нм).
4. Для образцов, содержащих ?-меркаптоэтанол и SDS , разведение белка готовят при помощи буфера (2% SDS , 10% глицерин, 5% ?- меркаптоэтанол, 0.065 M Трис- HCl pH 6,8).
Растворение панцирей диатомовых водорослей
1. Для подборки условий растворения отбираются клетки (например: A . baicalensis , C . baicalensis , C . minuta , S . acus ) так, чтобы они находились в одинаковом состоянии (наличие хлоропластов и толщина панциря) при помощи инвертирующего микроскопа Axiovert -200.
2. Клетки промывают водой дважды и растворяют в 1 М раствор NH 4 F , pH 5 в течение 30, 60, 90, 120, 150, 180, 300 c . После чего буферный раствор удаляют и промывают дистиллированной водой 4-5 раз.
3. Материал исследуется при помощи сканирующего электронного микроскопа (например: SEM 525-M (“Philips'”, Япония)) (Петрова и др., 2004).
Имммунохимический анализ белковых фракций методом Westrn blot
1. Белковые фракции наносятся на SDS -ПААГ (для лучшего разделения белков диатомей удобнее использовать градиентный гель 5-20% без концентрирующего в TGB буфере), так чтобы каждой пробы и маркера молекулярных масс было по две повторности – тестирования качества проб и электрофореза окрашиванием Кумаси, и для иммунохимического анализа. Электрофорез проводят при стандартных условиях: 20 мин – 50 V , затем на 100 V .
2. После окончания электрофореза, стекла вынимают из камеры, разнимают, часть геля окрашивают Кумаси, вторую перекладывают в камеру для переноса.
3. Подготовка камеры для переноса: перенос ведется в буфере (БДП): 3л – 7.86 г Трис- Cl , 33.75 г Глицина, 600 мл Этанола (Метанола). Камера заполняется небольшим количеством БДП, в котором смачивается нижняя прокладка из фильтровальной бумаги, на нее аккуратно перекладывают гель на подготовленную фильтровальную бумажку, поверх него накладывают мембрану (НЦ- нитроцеллюлоза или PVDF ( PVDF предварительно активируется в метаноле 10-15с, после чего нельзя допускать ее высушивания). Мембрану сверху закрывают еще несколькими слоями фильтровальной бумаги и аккуратно зажимают камеру. Перенос ведут при 250 mA – 45мин./200 mA – 1-1,5ч/ 175 mA – не менее 1,5 ч.
4. После чего (если перенос вели на PVDF мембрану, то ей не дают высыхать) мембрану подписывают в соответствии с образцами, отмечают карманы и разрезают. Мембрану с маркером молекулярных масс отрезают и окрашивают в Кумаси 3-5 мин, затем отмывают краску.
5. Мембрану промывают 5-6 раз водой по 3-5 мин, затем еще три раза рабочим раствором (РБх10 100мл: Трис- Cl 1.211г, NaCl 8.753 г , БСА 10 г , Твин-20 500 мкл) и проводят забивку 1 ч Блокирующим Буфером (ББх10 100мл: Трис- Cl 1.211г, NaCl 8.753 г , БСА 10 г ) на качалке (на этом этапе окрашивание можно приостановить, высушить мембрану до дальнейшего окрашивания, PVDF мембрану надо будет перед дальнейшим использованием опять активировать в метаноле).
6. После забивки ведут инкубацию с первичными антителами 2 ч при комнатной температуре, разведенными на РБ, так же при покачивании.
7. Повторяют промывку водой и РБ. Повторную забивку проводят 1 ч при комнатной температуре или можно ночь при +4 0С.
8. После чего инкубируем мембраны со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (разведение 1:25 000 или 1: 10 000, подбирается экспериментально), 2 часа при комнатной температуре. После чего промываем троекратно водой и один раз РБ. И проявляют нитроцеллюлозу в растворе с хромогенами (10 мл р-ра NaCl 0,9%, забуференного 0,1-0,5% БСА: 2,5 мг ДАВ (диаминобензидина), предварительно за 40 мин растворенного в воде, / заместо ДАВ можно использовать хлорнавфтол 10 мг, растворенный в 500 мкл спирта, 2,5 мкл 30% ).
9. Проявку останавливают промывкой в воде несколько раз и высушивают, избегая попадания прямых солнечных лучей. Полученный результат сканируют и сопоставляют с частью геля окрашенного Кумаси.
Приборный центр "Электронная микроскопия" © 2002