Методы, используемые в отделе

Методы фиксации и заливки образцов для ТЭМ

  1. Методика фиксирования и приготовления ультратонких срезов клеток простейших и микроводорослей.

  2. Метод фиксации и заливки диатомовых водорослей в блок (используется д-ром R.Crawford, AWI, Bremerhaven, Germany)

  3. Метод фиксации и заливки диатомовых водорослей в плоскости

  4. Методика подготовки нервной ткани для просвечивающей электронной микроскопии.

  5. Схема подготовки микроорганизмов для просвечивающей электронной микроскопии

  6. Фиксация диатомовых водорослей (по Pickett-Heaps, Hill, Wetherbee, 1986)

Методы молекулярной биологии

  1. АМПЛИФИКАЦИЯ (PCR)

  2. Отбор клеток диатомовых водорослей из свежих или фиксированных проб фитопланктона для последующего выделения суммарной ДНК и амплификации.

  3. Выделение суммарной клеточной ДНК из выборки клеток диатомовых водорослей с использованием СТАВ-буфера.

  4. Выделение ДНК

  5. Выделение суммарного цитоплазматического белка

  6. Выделение суммарного цитоплазматического белка из клеток S. acus

  7. Очистка реакций секвенирования ДНК от невключившихся BigDye-ddNTP

  8. Фракционирование белков E. coli

  9. Метод выделения ДНК из индивидуальных клеток ДВ для использования в ПЦР (Щербакова Т.А.)

Методы мониторинга

  1. Методика окрашивания флагеллят примулином.

Методы подготовки образцов для СЭМ

  1. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane Christian Laforsch and Ralph Tollrian

  2. TECHNIQUES FOR PREPARING CRUSTACEANS FOR SCANNING ELECTRON MICROSCOPY Bruce E. Felgenhauer (Перевод)

  3. Particle capture and processing mechanisms in Sabellaria alveolata (Polychaeta: Sabellariidae) Stanislas Dubois, Laurent Barille, Bruno Cognie, Peter G. Beninger

Ссылки:

Электронная микроскопия
Контрастирование ультратонких срезов
PEARL


Метод фиксации и заливки диатомовых водорослей в блок (используется д-ром R.Crawford, AWI, Bremerhaven, Germany)

  1. 1% OsO4, 1 мин.
  2. Отмывка: добавить в пробирку 0,1М фосфатный буфер, рН=7,1, центрифугировать 5 мин., повторить еще раз
  3. 3% глютаровый альдегид, 1 час.
  4. Отмыть буфером 2-4 раза, можно оставить в буфере на 6 час.
  5. Проводка в спиртах по 10 мин. с осаждением центрифугированием: 10% -> 30% -> 50% -> 70% -> 90% ->100% -> 100%
  6. Заливка:
    продолжительностьсостав смеси в частях
     100% этанол смола
    ночь31
    день22
    ночь13
  7. Полимеризация: не менее 8-12 часов при 60оС

С вопросами обращаться по адресу yel@lin.irk.ru

вверх

Метод фиксации и заливки диатомовых водорослей в плоскости

  1. Обезвоживание:
  2. Насыщение смолой:
  3. Удалить супернатант пипеткой, осадок встряхнуть в остатке супернатанта и залить 100% смолой на 30 мин.
  4. В это время приготовить стекла:
  5. Центрифугировать 10 мин., смолу удалить
  6. Остаток смолы с осадком перемешали, капнули в чашку и равномерно в ней распределили
  7. По несколько капель нанесли на стекла, равномерно распределили и накрыли сверху вторым предметным стеклом
  8. Залили остаток смолы в пустые капсулы для получения пустых блоков, к которым будут приклеиваться плоские блоки
  9. Полимеризация ночь при 60оС
  10. На следующий день стекла разлепили, из чашек вынули блок
  11. Под световым микроскопом проконтролировали плотность нанесения материала и состояние клеток, выбрали интересные участки
  12. Свежим лезвием изготовили пирамидки из пустых блоков
  13. 1/4 обычноголезвия для бритья вырезали из смолы выбранные объекты и отделили их от стекла.
  14. Тут же замесили на стекле эпоксидный клей и приклеили им вырезанные кусочки к пустому блоку
  15. Выдержали 1 час при 60оС, чтобы застыл клей
  16. Получили ультратонкие срезы с помощью алмазного ножа
  17. Окрасили их на капле насыщенного раствора уранил-ацетета (1 мин.), отмыли споласкиванием сеточки в дист воде, окрасили на капле цитрата свинца.
  18. Сполоснули, разместили на фильтровальной бумане в чашке П. для высыхания.
  19. Препарат готов для просмотра в ТЭМ.

С вопросами обращаться по адресу yel@lin.irk.ru

вверх

АМПЛИФИКАЦИЯ (PCR)

Реактивы

Метод

Для каждого реактива и каждого вида ДНК - новый носик

Расчет фермента: 2х (n+1) = Vф мкл 0,1Vф 10 x PCR буф +0,3х(n+1) фермента +Н2О бд

Аналитический электрофорез в 1% агарозном геле

Электрофорез проводят при U = 80в, в течение 30-40 мин.
Продукты амплификации, окрашенные бромистым этидием, наблюдают в УФ свете, фотографируют.

Литература

  1. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование: Практическое пособие. М. Наука. 1981. 288 с.
  2. Дреипер Дж., Скотт Р., Армитижд Ф., Уолден Р., Генная инженерия растении . М.: Мир. 1991. 408 с.
  3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984. 480 с.
  4. Doyle J. J. & Doyle J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12 : 13-15.

С вопросами обращаться по адресу tsherb@lin.irk.ru

вверх

Отбор клеток диатомовых водорослей из свежих или фиксированных проб фитопланктона для последующего выделения суммарной ДНК и амплификации.

Клетки или колонии диатомовых водорослей отбирают по морфологическим маркерам, характерным для исследуемого вида (форма, размер, структура панциря или колоний, наличие спор и т.д.). Отбор клеток ведут из свежих или фиксированных в 80% этаноле водных проб с помощью микропипетки, оттянутой из стеклянного капилляра (диаметром 0.5-0,3 мм), под бинокулярной лупой. Выборка клеток для получения количества ДНК, достаточного для проведения последующих реакций амплификации, составляет две - три сотни клеток.

  1. 5 -10 мкл пробы (в зависимости от ее концентрированности) помещаются на предметное "часовое" стекло в каплю дистиллированной воды ("первая капля").
  2. Наблюдая в бинокулярную лупу, нужные клетки (колонии) водоросли микропипеткой аккуратно переносят в следующую каплю ("вторую").
  3. Повторяя пункт 2, отбираемые клетки последовательно проводят через 4-6 капель дистиллята, для того, чтобы конечная выборка была очищена от механических примесей и состояла только из клеток исследуемого вида. Финальная капля контролируется под микроскопом на большом увеличении.
  4. Клетки из последней капли переносят в эппендорф объёмом 1,5 мкл, для выделения нуклеиновых кислот или хранят в 80% этиловом спирте при 4оС.

Литература

  1. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование: Практическое пособие. М. Наука. 1981. 288 с.
  2. Дреипер Дж., Скотт Р., Армитижд Ф., Уолден Р., Генная инженерия растении . М.: Мир. 1991. 408 с.
  3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984. 480 с.
  4. Doyle J. J. & Doyle J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12 : 13-15.

С вопросами обращаться по адресу tsherb@lin.irk.ru

вверх

Выделение суммарной клеточной ДНК из выборки клеток диатомовых водорослей с использованием СТАВ-буфера.

Метод выделения суммарной клеточной ДНК из растительного материала основан на том, что при высоких концентрациях солей, нуклеиновые кислоты образуют стабильные и растворимые соединения с цетилтриэтиламмоний бромидом. При снижении концентрации соли NaCl ниже 0,4 М комплекс СТАВ/н.к. выпадает в осадок.

После разрушения клеток белки денатурируют и экстрагируют смесью хлороформа с изоамиловым спиртом. СТАВ удаляют путем осаждения этанолом (СТАВ растворим в этаноле, а ДНК нет).

Для выделения суммарной клеточной ДНК из диатомовых водорослей используют СТАВ-буфер следующего состава: 3% СТАВ, 1,4 М NaCl, 0,2% 2-меркаптоэтанол, 20 mM EDTA, 100 mM Tris -HCl (pH 8,0).

Выделение:

  1. отобранные клетки отмывают от фиксатора (если проба фиксирована 80% этанолом) центрифугированием в течение 5', удалением спирта, добавлением воды; повторяют - 2 раза;
  2. отбирают надосадочную воду, а осадок заливают 50 - 100 мкл предварительно прогретого при 60оС СТАБ-буфера, помещают пробирку в термостат (60оС) и тщательно растирают пестиком в течение 5 минут для разрушения прочных кремнистых стенок;
  3. добавляют еще 100 мкл СТАБ-буфера и инкубируют в термостате при 60оС в течение 30 минут, периодически перемешивая раствор вращением пробирки (трясти пробирку не рекомендуется т. к. буфер пенится, ДНК разрушается);
  4. остудив пробирку до комнатной температуры, добавляют равный объём смеси хлороформ - изоамиловый спирт (24:1) и перемешивают медленным покачиванием в течение 10 мин;
  5. разделяют фазы центрифугированием 10 мин (15000 об/мин)
  6. супернатант переносят в чистую пробирку объемом 1,5 мл
  7. добавляют 2/3 объема изопропанола
  8. оставляют на ночь при -20о для осаждения ДНК
  9. центрифугируют 20 мин, отбирают изопропанол
  10. добавляют два объема 80% этанола, инкубируют 20 мин, центрифугируют 2 мин, тщательно удаляют спирт, подсушивают пробирку на воздухе для удаления паров спирта
  11. осадок ДНК растворяют в 20 мкл воды или ТЕ-буфера (0,01М трис-HCl, pH-7,4, 0,1mM EDTA), до полного исчезновения осадка (прогревание при 60оС в течение 10 - 20 мин способствует растворению).

Полученный препарат тотальной ДНК (примерно 0,3 -0,8 нг ДНК) хранят в холодильнике, не замораживая, используют для реакций амплификации и др.

Литература

  1. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование: Практическое пособие. М. Наука. 1981. 288 с.
  2. Дреипер Дж., Скотт Р., Армитижд Ф., Уолден Р., Генная инженерия растении . М.: Мир. 1991. 408 с.
  3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984. 480 с.
  4. Doyle J. J. & Doyle J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12 : 13-15.

С вопросами обращаться по адресу tsherb@lin.irk.ru

вверх

Методика подготовки нервной ткани для просвечивающей электронной микроскопии.

  1. Изолированная ткань с помощью острого лезвия рассекается на отдельные небольшие фрагменты (1-3 мм3) и фиксируется 1-2 часа при температуре +4 С в 2,5 % растворе глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2-7,4);
  2. Промывание образцов в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2-7,4) 10 мин;
  3. Фиксация материала в 1-2 % р-ре OsO4 на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2-7,4) 1-12 час. на холоду (+4 С);
  4. Обезвоживание в спиртах восходящей концентрации: 30%, 50%, 70%, 96%, 100%, абсолютный ацетон (в каждом из растворов объекты выдерживаются по 20-30 мин.);
  5. Изготавливается заливочная смесь, состоящая из следующих компонентов эпоксидных смол: эпон 812 (4,5 мл.) + MNA (2,23 мл.) + DDSA (2,72) +DMP-30 (5 капель). Смесь тщательно перемешать стеклянной палочкой. (Заливочная смесь может храниться в морозильной камере холодильника);
  6. Кусочки обезвоженной ткани далее инфильтруются растворами абсолютного ацетона и заливочной смолы по схеме:
  7. Кусочки ткани, пропитанные смолой, опускаются и ориентируются в желатиновых капсулах, предварительно заполненных свежей заливочной смолой;
  8. Полимеризация образцов в термостате 37 С 12 час., 45 С 12 час., 60 С 48 час.;
  9. Заточка блоков, получение полутонких и ультратонких срезов, монтирование срезов на сеточки;
  10. Контрастирование ультратонких срезов в цитрате свинца по Рейнольдсу.

Литература:

  1. А.А. Миронов, Я.Ю. Комиссарчик, В.А. Миронов. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. Санкт-Петербург. Наука. 1994;
  2. В.Я. Карупу. Электронная микроскопия. Киев.1984;

С вопросами обращаться по адресу klimneurobio@hotbox.ru

вверх

Методика фиксирования и приготовления ультратонких срезов клеток простейших и микроводорослей.

  1. Живые клетки из пробы или культуры концентрируют, осаждая в центрифуге при скорости 5-8 тыс об / мин. (диаметр ротора 12 см).
  2. Материал из проб или культур фиксируют смесью глутаральдегида забуференного 0.2 М какодилатом натрия (рН 7.4) и четырехокиси осмия, (конечные концентрации соответственно 0.5 и 0.25%) в течении 30-40 минут при +40С. Последние 5 минут материал в фиксаторе осаждают, центрифугируя при скорости 2 тыс об/мин. (диаметр ротора 12 см.). Фиксатор осторожно сливают, осадок заливают горячим агаром 0.5% (минимальное количество).
  3. Агар с клетками помещают в какодилатный буфер (рН 7.4) и скальпелем вырезают кусочки с материалом так, чтобы "свободного" агара не оставалось.
  4. Кусочки агара помещают в четырехокись осмия 1% для постфиксации и выдерживают в течении часа на холоду (обычно на чашке со льдом).
  5. Объекты проводят через этиловый спирт возрастающей концентрации и ацетон: 30 (15') - 50 (15') - 70 (15') - 70 (15'; можно также хранить длительное время) - 80 (15') - 96 (15') - 96 (15') - cмесь спирт-ацетон 1:1 (15') - ацетон (15') - ацетон (15') - смесь ацетон-смола 1:1 (12-24 часа)
  6. Материал помещают в смолу. Дальнейшие действия по стандартной методике.

Литература

  1. Mignot J-P. Etude ultrastructurale d'un flagella du genere Spumella Cienk. (Chrysomonadine leucoplastidee) // Protistologica.- 1977.- Vol. 13 (2).- 219-231.
  2. Preisig H.R., Hibberd D.J. Ultrastructure and taxonomy of Paraphysomonas (Chrysophyceae) and related genera 1 // Nord. J. Bot. - 1982. - Vol. 2 (5).- 397-420.

С вопросами обращаться по адресу klimneurobio@hotbox.ru

вверх

Методика окрашивания флагеллят примулином

Приготовление раствора примулина

Приготовление постоянных препаратов для эпифлуоресцентной микроскопии (ЭФМ)

С вопросами обращаться по адресу katrin@lin.irk.ru

вверх

Выделение суммарного цитоплазматического белка из клеток S. acus

(при помощи набор для выделения клеточных белков Total Protein Kit фирмы Bio - Rad (“Bio-Rad”, США)).

1. Клетки в количестве 150 млн концентрируют из культуральной среды при помощи фильтровальной установки (“ Millipore ”, США).

2. Клетки отмывают от среды центрифугированием ( 7 500 g , 15 мин, MiniSpin , “ Eppendorf ”, Германия) надосадочную жидкость удаляют, а к осадку добавляют воду, процедуру повторяют.

3. Осадок клеток растирают до гомогенного состояния в ступке на холоде в течение 5 мин для разрушения прочных кремнистых стенок, контролируя степень разрушения створок под микроскопом ( Axiovert 200, “ Zeiss ”, Германия).

4. Гомогенат переносят в пластиковую пробирку на 1,5 мл и добавляют Total Protein 300 мкл, обрабатывают ультразвуком в течение 4 мин с охлаждением.

5. Осаждают центрифугированием ( 7 500 g , 30 мин) , отбирают супернатант, который в дальнейшем использовали как образец для нанесения на электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).



Выделение суммарного клеточного белка с предварительным растворением панцирей диатомовых водорослей

1. Для растворения кремнистого панциря и освобождения связанного с ним органического материала проводят обработку клеток 5М фторидом аммония ( NH 4 F ), pH 5.0, (4 оС, 12 ч) в присутствии ингибиторов сериновых и цистеиновых протеаз 3 мМ ФМСФ ( m / v ) и 3 мМ йодуксусной кислоты ( m / v ).

2. Образовавшийся после центрифугирования ( 12 100 g , 3 мин) осадок ресуспендируют в 500 мМ Трис- HCl , pH 8.8, и центрифугируют в тех же условиях. Промывку повторяли дважды.

3. Затем осадок обрабатывают ультразвуком и проводят карбоксиметилирование 5 мМ йодуксусной кислотой в 0.25 М Трис- HCl , рН 8.8, в присутствии 3 мМ ФМСФ (1 ч, 4 оС, m / v ).

4. Для разрушения дисульфидных связей и солюбилизации белков к осадку добавляют ?-меркаптоэтанол до концентрации 52 мМ в 2 %-ном растворе SDS в 0.25 М Трис- HCl , pH 8.8, полученную суспензию перемешивают при 37 оС в течение 12 ч.

5. Для защиты меркапто-групп цистеина белки повторно карбоксиметилируют, добавляя йодуксусную кислоту до концентрации 54 мМ . Смесь центрифугируют при 12   100 g в течение 2 мин и из супернатанта осаждают белки 80% метанолом ( v / v ) на холоде.

6. Белки растворяют в буфере для нанесения на гель (1% SDS , 10% глицерин, 100 мМ ?-меркаптоэтанол, 50 м M Трис- HCl , pH 6.8) и анализируют с помощью электрофореза в градиенте 5-20% ПААГ (Петрова и др., 2007).



Последовательная экстракция белков из клеток диатомовых водорослей

1. Клетки в количестве 5-8 х10 6, концентрируют фильтрованием и промывают трижды 10 mM Tris - Cl /1 mM C aCl 2 pH 7.4 ( TC буфер).

2. После последней промывки, клетки перенесят в ступку и растирают на холоде c TC буфером, полученный гомогенат центрифугируют, супернатант перенесят в отдельную пробирку – TC -экстракт.

3. Клетки промывают пятикратно TC буфером и добавляют 100 mM этилендиаминтетрауксусную кислоту ( EDTA ) рН 7.8 и инкубируют 12 ч при комнатной температуре, на качалке.

4. Затем, центрифугируют, собрют супернатант – EDTA -экстракт. Осадок промывают водой трижды и инкубируют 30 мин с 1 M NaCl – NaCl -экстракт.

5. Осадок обрабатывают 8 M мочевиной 30 мин, при комнатной температуре, на качалке – эстракт 8 М мочевины.

6. Материал после экстракции трижды промывают водой и мембранные белки экстрагируют 2% SDS при 37 OС, 12 ч, супернатант собирают– SDS -экстракт.

7. Все этапы экстракции проводят в присутствии ингибиторов сериновых и цистеиновых протеаз: 3 мМ ФМСФ и 3 мМ йодуксусной кислоты ( m / v ). полученные белковые экстракты концентрируют 80% метанолом ( v / v ) , 10 мин на холоде. Образцы анализируют с помощью электрофореза в градиенте 5-20% ПААГ ( Frigeri et al , 2006).



Выделение белков, ассоциированных с панцирем диатомовых водорослей

1. Культуру клеток S . acus выращивают на среде ДМ. После того, как количество клеток в культуре достигло 896·10 6, клетки отделяют от среды, как это описывалось раньше.

2. Осадок клеток переносят в пластиковую пробирку и трижды промывают водой.

3. К клеткам ( V =500 мкл) добавляют SDS и EDTA , до концентрации 2% и 0,2М, соответственно, перемешивают при помощи пипетирования и инкубируют на водяной бане ( t = 95 о C ) в течение часа. Центрифугируют ( 7 500 g , 15 мин) и убирают надосадочную жидкость.

4. Осадок промывают водой и повторяют обработку SDS / EDTA дважды. Полученный осадок после третьего кипячения трижды промывают водой и высушивают до сухого веса ( m = 100 мг). После чего к осадку добавляют раствор 2 M NH 4 F , pH 5.0 до полного растворения створок ( V конечный = 56 мл).

5. Полученный раствор диализуют против раствора NH 4 F 1% ( v / v ), c добавлением 3 мМ ФМСФ ( m / v ) в течение 12 час.

6. Супернатант и осадок, выпавший при диализе, разделяют, центрифугированием ( 7 500 g , 15 мин).

7. Осадок обрабатывают буфером (2% SDS , 10% глицерин, 5% ? - меркаптоэтанол, 0,065 M Трис- HCl pH 6,8) трижды по 5 мин на водяной бане (95 оС), после каждого раза центрифугируют ( 12   100 g , 3 мин), отбирают супернатант, а осадок заливают новой порцией буфера.

8. В дальнейшем супернатант используют как образец для измерения поглощения на длинах волн 220-300 нм и для ПААГ-электрофореза.



Определение концентрации белка по методу Брэдфорда

1. Для определения концентрации белка по методу Брэдфорда ( Bradford, 1976) строится калибровочная кривая стандартного раствора бычьего гамма глобулина (БГГ, 2 мг/мл) Bio - Rad .

2. Подготавливают следующие разведения БГГ: 1000 мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 61 мкг/мл, 30,6 мкг/мл, 15 мкг/мл и 7,6 мкг/мл. К 50 мкл белкового раствора добавлют 200 мкл реагента Брэдфорда, затем измеряют оптическую плотность при помощи спектрофотометра “ SmartSpec TM Plus ” ( Bio - Rad) на 595 нм.

3. Из образцов, полученных при выделении белка, отбирают по 50 мкл, добавляют 200 мкл реагента Брэдфорда, измеряют оптическую плотность (595 нм).

4. Для образцов, содержащих ?-меркаптоэтанол и SDS , разведение белка готовят при помощи буфера (2% SDS , 10% глицерин, 5% ?- меркаптоэтанол, 0.065 M Трис- HCl pH 6,8).



Растворение панцирей диатомовых водорослей

1. Для подборки условий растворения отбираются клетки (например: A . baicalensis , C . baicalensis , C . minuta , S . acus ) так, чтобы они находились в одинаковом состоянии (наличие хлоропластов и толщина панциря) при помощи инвертирующего микроскопа Axiovert -200.

2. Клетки промывают водой дважды и растворяют в 1 М раствор NH 4 F , pH 5 в течение 30, 60, 90, 120, 150, 180, 300 c . После чего буферный раствор удаляют и промывают дистиллированной водой 4-5 раз.

3. Материал исследуется при помощи сканирующего электронного микроскопа (например: SEM 525-M (“Philips'”, Япония)) (Петрова и др., 2004).



Имммунохимический анализ белковых фракций методом Westrn blot

1. Белковые фракции наносятся на SDS -ПААГ (для лучшего разделения белков диатомей удобнее использовать градиентный гель 5-20% без концентрирующего в TGB буфере), так чтобы каждой пробы и маркера молекулярных масс было по две повторности – тестирования качества проб и электрофореза окрашиванием Кумаси, и для иммунохимического анализа. Электрофорез проводят при стандартных условиях: 20 мин – 50 V , затем на 100 V .

2. После окончания электрофореза, стекла вынимают из камеры, разнимают, часть геля окрашивают Кумаси, вторую перекладывают в камеру для переноса.

3. Подготовка камеры для переноса: перенос ведется в буфере (БДП): 3л – 7.86 г Трис- Cl , 33.75 г Глицина, 600 мл Этанола (Метанола). Камера заполняется небольшим количеством БДП, в котором смачивается нижняя прокладка из фильтровальной бумаги, на нее аккуратно перекладывают гель на подготовленную фильтровальную бумажку, поверх него накладывают мембрану (НЦ- нитроцеллюлоза или PVDF ( PVDF предварительно активируется в метаноле 10-15с, после чего нельзя допускать ее высушивания). Мембрану сверху закрывают еще несколькими слоями фильтровальной бумаги и аккуратно зажимают камеру. Перенос ведут при 250 mA – 45мин./200 mA – 1-1,5ч/ 175 mA – не менее 1,5 ч.

4. После чего (если перенос вели на PVDF мембрану, то ей не дают высыхать) мембрану подписывают в соответствии с образцами, отмечают карманы и разрезают. Мембрану с маркером молекулярных масс отрезают и окрашивают в Кумаси 3-5 мин, затем отмывают краску.

5. Мембрану промывают 5-6 раз водой по 3-5 мин, затем еще три раза рабочим раствором (РБх10 100мл: Трис- Cl 1.211г, NaCl 8.753 г , БСА 10 г , Твин-20 500 мкл) и проводят забивку 1 ч Блокирующим Буфером (ББх10 100мл: Трис- Cl 1.211г, NaCl 8.753 г , БСА 10 г ) на качалке (на этом этапе окрашивание можно приостановить, высушить мембрану до дальнейшего окрашивания, PVDF мембрану надо будет перед дальнейшим использованием опять активировать в метаноле).

6. После забивки ведут инкубацию с первичными антителами 2 ч при комнатной температуре, разведенными на РБ, так же при покачивании.

7. Повторяют промывку водой и РБ. Повторную забивку проводят 1 ч при комнатной температуре или можно ночь при +4 0С.

8. После чего инкубируем мембраны со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (разведение 1:25 000 или 1: 10 000, подбирается экспериментально), 2 часа при комнатной температуре. После чего промываем троекратно водой и один раз РБ. И проявляют нитроцеллюлозу в растворе с хромогенами (10 мл р-ра NaCl 0,9%, забуференного 0,1-0,5% БСА: 2,5 мг ДАВ (диаминобензидина), предварительно за 40 мин растворенного в воде, / заместо ДАВ можно использовать хлорнавфтол 10 мг, растворенный в 500 мкл спирта, 2,5 мкл 30% ).

9. Проявку останавливают промывкой в воде несколько раз и высушивают, избегая попадания прямых солнечных лучей. Полученный результат сканируют и сопоставляют с частью геля окрашенного Кумаси.




Приборный центр "Электронная микроскопия" © 2002